Evaluación de la técnica PCR-RFLP para tipificación del locus MSP3α DE P. vivax en aislados colombianos
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Resumen en ingles
Malaria is an important public health disease. This illness is caused by parasites of the Plasmodium genus being Plasmodium vivax the second most important human malaria parasite. This species is widely distributed and it is able to produce severe forms of malaria and recurrence by hypnozoites. In addition, several strains have been shown drug-resistance, therefore epidemiological analyzes are needed to design control and surveillance strategies. The msp3α locus is a highly polymorphic gene which has been used extensively for epidemiological analyzes in different regions around the world by using the PCR-RFLPs technique. However, recent studies have questioned the usefulness and reproducibility of this technique since it seems to be underestimating the genetic diversity of P. vivax. Consequently, the aim of this study is to analyze the concordance of the PCR-RFLPs technique with sequence data of 72 P. vivax samples from Colombia parasite population. Here, were analyzed 72 msp3α sequenced samples from 5 Colombia’s departments. The sequences were aligned with Muscle algorithm and the haplotypes number was determined by using the DnaSP v.6 software. Then, an in silico enzymatic digestion was performed with the Alu I and Hha I enzymes defining the haplotypes that these enzymes would generate. The sequence and digestion data were then compared. The sequencing data showed 58 haplotypes in the 72 samples analyzed, while the RFLPs (the in silico analysis) showed only 30 haplotypes. The haplotypes obtained by restriction with Alu I and Hha I enzymes during the RFLPs technique do not agree with the number obtained by sequencing, therefore, this technique is not useful for genetic diversity and/or epidemiological analysis in Colombia.
Resumen en español
La malaria es una enfermedad de importancia en salud pública la cual es causada por parásitos del género Plasmodium. Entre las principales especies que afectan al humano se encuentra P. vivax, especie ampliamente distribuida que puede producir formas graves de malaria, recurrencias por hipnozoitos y generar resistencia a fármacos, por lo que análisis epidemiológicos son importantes para diseñar estrategias de control y vigilancia. El locus msp3α es un gen altamente polimórfico el cual ha sido utilizado ampliamente para análisis epidemiológicos en diferentes regiones del mundo mediante la técnica de PCR-RFLPs. Sin embargo, recientes estudios han puesto en duda la utilidad y reproducibilidad de esta técnica dado que parece estar subestimando la diversidad genética de P. vivax. Por tal motivo, el objetivo del presente estudio es analizar la concordancia de la técnica PCR-RFLPs con datos de secuencia de 72 muestras de P. vivax obtenidas en Colombia. Se analizaron 72 muestras secuenciadas de msp3α provenientes de 5 departamentos de Colombia. Estas fueron alineadas con el algoritmo Muscle y se determinó el número de haplotipos por medio del software DnaSP v.6. Posteriormente, se realizó la digestión enzimática in silico con las enzimas Alu I y Hha I definiendo los haplotipos que estas generarían. Los datos de secuencia y digestión fueron entonces comparados. Los datos de secuenciación mostraron 58 haplotipos en las 72 muestras analizadas, mientras los RFLPs (el análisis in silico) mostró solo 30 haplotipos. Los haplotipos obtenidos por restricción con las enzimas Alu I y Hha I durante la técnica de RFLPs no concuerdan con el número obtenido por medio de análisis de secuenciación, por ende, esta técnica no es viable para estudios de diversidad genética o análisis epidemiológicos en Colombia empleando las enzimas Alu I y Hha I.