Examinando por Autor "Suárez Barrera, Miguel Orlando"
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- PublicaciónAcceso abiertoAnálisis estructural y determinación de la actividad tóxica de las mutantes 8cry11l553f, 8cry11l556w, y 8cry11l553f-l556w obtenidas por mutagénesis sitio dirigida en larvas de primer estadio de aedes aegypti.(Bucaramanga : Universidad de Santander, 2018, 2018-11-23) Herrera Pineda, Diego Fernando; Suárez Barrera, Miguel Orlando; Rueda Forero, Nohora JulianaBacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium, δ-endotoxins producer that are toxic to different orders of insects and nematodes. Cry11 is a specific toxin against the vector A. aegypti, which is responsible for the transmission of dengue, zika and chikungunya; however, its mode of action and structure-function characteristics have not yet been fully elucidated. The research group of Molecular Biology and Biotechnology of the UDES, has a library obtained by shuffling the DNA of cry11 genes, highlighting the variant 8Cry11, which is 6 times more toxic than Cry11Aa and 3.8 more than Cry11Bb. Molecular Docking studies showed that positions 553 and 556 of this protein are relevant in the interaction with the cadherin receptor, to corroborate this information, site-directed mutagenesis was performed to reverse the aforementioned mutations, obtaining the variants 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, and 8Cry11L553F-L556W. In this work, the toxic activity of mutants 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, and 8Cry11L553F-L556W was determined, as well as an approximation of protein analysis both in silico and in vitro through SDS-PAGE. To achieve this, the ideal conditions for the production of δ-endotoxin (Cry11Aa) were standardized, finding a relationship between glucose concentrations (15g / L) and sources of organic and inorganic nitrogen in a ratio of 3: 7; the production of protoxin (~ 100 kDa) and toxin (32 and 34 kDa) was corroborated by SDS page. To determine the mean lethal concentration in comparison with the mutant 8Cry11 and the parental Cry11Aa, the toxicity of the mutants was evaluated, against first stage larvae of A. aegypti. The results showed loss of toxicity for the variants under study, which indicated that substituted amino acids in domain III were strongly possible involved in the loss of toxicity due to structural features.
- PublicaciónAcceso abiertoCaracterización de la Diversidad Microbiana de Suelos Destinados a Cultivos de Ananas comosus (piña), Tratados con Distintos Plaguicidas en el Municipio de Lebrija, Santander(Bucaramanga : Universidad de Santander, 2021, 2021-05-06) Bravo Granados, Natalia Andrea; Rueda Forero, Nohora Juliana; Suárez Barrera, Miguel OrlandoEl suelo es un hábitat diverso, su composición varía dependiendo del uso, condiciones climáticas y actividades antropogénicas; y conocer los microorganismos presentes requiere la implementación de herramientas de secuenciación de nueva generación. Ananás comosus es un cultivo de gran importancia para Santander, sin embargo, los estudios referentes a la caracterización biológica del suelo asociado, son escasas en la región y en el país. En ese sentido, este trabajo se centró en la caracterización microbiana del suelo destinado a un cultivo de piña. Para lograrlo, las muestras se tomaron aleatoriamente de cuatro lotes a 20 cm de profundidad, obteniendo un total de 14 muestras. Se estandarizó el protocolo de extracción de ADN genómico total de suelo y la cantidad de ADN de cada muestra fue >60 ng/μl. Posteriormente se enviaron a secuenciar a MacroGen mediante la plataforma Illumina MiSeq (2x300 pb), obteniéndose un total de 1’518.101 secuencias de las muestras analizadas. El empleo de herramientas metagenómicas como el FASTQC y el MG-RAST, permitieron establecer la calidad de las secuencias obtenidas y la clasificación desde dominio hasta género de los microorganismos presentes en los suelos estudiados. Filo como Actinobacteria (>50%), Acidobacteria (>18%), Firmicutes (>16%) y Verrumicrobia (>10%), se encontraron con mayor predominancia entre las 14 muestras estudiadas. A nivel de género se encontraron en abundancia Candidatus Koribacter, Streptomyces, Isosphaera, Bacillus, Candidatus Solibacter y Actinomadura. Con respecto a la diversidad α, esta varía por las condiciones nutricionales del suelo, es por esto que en la muestra del suelo Blanco los valores de esta diversidad son los más bajos. Finalmente, se evidenció elevada similitud entre la composición de las comunidades microbianas de los cuatro suelos en estudio, indicando que el plaguicida y el bioplaguicida, no tienen un efecto significativo en la composición de la población microbiana presentes en la rizosfera del cultivo de piña.
- PublicaciónAcceso abiertoCaracterización de nuevas proteínas Cry11 obtenidas por modelos heurísticos computacionales(Bucaramanga : Universidad de Santander, 2018, 2018-11-23) Abaunza Villamizar, Sebastián Mauricio; Suárez Barrera, Miguel OrlandoBacillus thuringiensis (Bt) is a Gram positive bacterium with parasporal inclusion bodies, also called δ-endotoxins, within these is the Cry protein that is known for its toxic activity against multiple orders of insects and nematodes, the vector-borne diseases A. aegypti, it transmites several important diseases in public health such as Dengue, Zika Chikungunya, among others. Cry11 has been recognized for its high specificity against A. aegypti. However, the emergence of resistance by insects that are the object of study, have resulted in the application of various strategies, for the improvement of proteins including site-directed mutagenesis and DNA shuffling. The use of biocomputational tools has expanded the spectrum in the development of molecules with greater potential, however, these strategies have not been described in the development of enhanced mutants of Cry. This work is based on the use of software HIDDEN 1.0 where libraries of in silico variants were obtained from Cry11Aa. Heu2, Heu3 and Heu4 variants were selected, and validated in vitro, they were synthesized, cloned into PSV2 and were expressed in E.coli DE3BL21 and B. thuringiensis BMB171, their electrophoretic profiles were analyzed in SDS-Page and their toxicity activity was evaluated by thick tests with A. aegypti. Parallel to this a structural analysis with matrix of MatGat, Bioedit and structural comparisons were contrasted with the literature. It was found that the variants presented an upper identity more than 97% with Cry11Aa, the changes mostly belonged to domain II, and their lethality percentages were less than 5%, which suggests that the amino acid changes in the important regions of the three domains are involved in the toxicity activity demonstrated by the proteins.
- PublicaciónAcceso abiertoDeterminación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp(Bucaramanga : Universidad de Santander, 2021, 2021-02-11) Olarte Díaz, Andrés Felipe; Cruz Laitón, Jennifer; Rueda Forero, Nohora Juliana; Suárez Barrera, Miguel OrlandoBacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por producir cristales parasporales -proteínas Cry- con efectos insecticidas frente a plagas. Sin embargo, en los últimos años se ha documentado que un grupo de proteínas Cry no presentan actividad insecticida o hemolítica, presentan actividad frente a bacterias o células cancerígenas. Aunque el mecanismo de acción de este grupo de proteínas no se ha elucidado completamente, la fragmentación de ésta en péptidos, acompañada con un soporte computacional pueden dar luces de los sitios de unión o la forma de internalización celular. La característica anfipática de este grupo de compuestos, péptidos, es crucial para la interacción con la membrana, donde las cargas positivas en este grupo de moléculas son importantes para generar selectividad, al interactuar de formas distintas con las membranas bacterianas, que están densamente poblados por fosfolípidos con carga negativa. Por consiguiente, pueden tener una alta probabilidad de ser antimicrobianos. Basados en estas consideraciones, en este estudio se evaluó la actividad de tres fragmentos peptídicos derivados de la proteína Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, bacteria que se caracteriza por afectar los cultivos de interés en la región nororiental de nuestro país. Inicialmente, se realizó una cinética de crecimiento para conocer el tiempo de duplicación de la cepa fitopatógena y se evaluó la actividad hemolítica de cada uno de los compuestos. Así mismo, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los péptidos frente a la bacteria anteriormente mencionada. Adicionalmente, las concentraciones analizadas de los compuestos fueron en un rango de concentración de 4 a 150μM, siendo el péptido Loop2-PS2Aa el más bioactivo obteniendo porcentajes de inhibición de 44.41% y 51.98% a las concentraciones de 100 μM y 150 μM, respectivamente. Asimismo, se evaluaron concentraciones más altas para este compuesto. Se empleó el agroquímico Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl) como control positivo a las mismas concentraciones que los péptidos mostrando una menor inhibición a concentraciones bajas en comparación con el péptido Loop2-PS2Aa. Sin embargo, a la concentración recomendada (2g/L o 9364.6 μM) para tratar especies fitopatógenas de Pseudomonas sp inhibió el 99.9% de crecimiento, siendo esta la CMB. Con los resultados obtenidos se pretende recopilar información acerca de posibles fragmentos bioactivos de la toxina Cry46Aa1 del dominio I, que aún no se han evaluado frente a bacterias fitopatógenas.
- PublicaciónAcceso abiertoDNA secondary structure formation by DNA shuffling of the conserved domains of the Cry protein of Bacillus thuringiensis(2017-12) Pinzón Reyes, Efraín-Hernando; Sierra, Daniel A.; Suárez Barrera, Miguel Orlando; Orduz, Sergio; Florez, Alvaro M.Background The Cry toxins, or δ-endotoxins, are a diverse group of proteins produced by Bacillus thuringiensis. While DNA secondary structures are biologically relevant, it is unknown if such structures are formed in regions encoding conserved domains of Cry toxins under shuffling conditions. We analyzed 5 holotypes that encode Cry toxins and that grouped into 4 clusters according to their phylogenetic closeness. The mean number of DNA secondary structures that formed and the mean Gibbs free energy (ΔG¯¯¯¯¯¯¯¯) were determined by an in silico analysis using different experimental DNA shuffling scenarios. In terms of spontaneity, shuffling efficiency was directly proportional to the formation of secondary structures but inversely proportional to ∆G. Results The results showed a shared thermodynamic pattern for each cluster and relationships among sequences that are phylogenetically close at the protein level. The regions of the cry11Aa, Ba and Bb genes that encode domain I showed more spontaneity and thus a greater tendency to form secondary structures (<∆G). In the region of domain III; this tendency was lower (>∆G) in the cry11Ba and Bb genes. Proteins that are phylogenetically closer to Cry11Ba and Cry11Bb, such as Cry2Aa and Cry18Aa, maintained the same thermodynamic pattern. More distant proteins, such as Cry1Aa, Cry1Ab, Cry30Aa and Cry30Ca, featured different thermodynamic patterns in their DNA. Conclusion These results suggest the presence of thermodynamic variations associated to the formation of secondary structures and an evolutionary relationship with regions that encode highly conserved domains in Cry proteins. The findings of this study may have a role in the in silico design of cry gene assembly by DNA shuffling techniques.
- PublicaciónAcceso abiertoIdentificación y Caracterización de Parasporinas, Obtenidas de Aislados de Bacillus spp Nativos de Suelos Colombianos(Bucaramanga : Universidad de Santander, 2021, 2021-01-28) Castro Pinzón, Yaren Yorlady; Suárez Barrera, Miguel Orlando; Rueda Forero, Nohora JulianaA pesar del desarrollo de diversos procedimientos médicos enfocados hacia el tratamiento del cáncer, al día de hoy siguen existiendo falencias en la preservación de tejidos sanos. Por lo anterior, las nuevas estrategias se han centrado en el uso de moléculas biológicas específicas con potencial anticancerígeno. En este sentido, durante los últimos años, han aumentado las investigaciones con Bacillus thuringiensis (Bt), un microorganismo Grampositivo caracterizado por la producción de inclusiones cristalinas que resultan tóxicas hacia varios órdenes de insectos. En los estudios más recientes se ha reportado que Bt también tiene la capacidad de sintetizar proteínas no insecticidas conocidas como Parasporinas (PS), las cuales producen cristales que presentan citotoxicidad contra diferentes líneas celulares de cáncer. El presente proyecto se enfocó en la identificación de genes parasporales en 13 aislamientos de Bacillus spp de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander aisladas de suelos colombianos, por medio de la estandarización de la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los análisis en geles de agarosa permitieron determinar la presencia de amplicones de interés para PS1 en los aislados 87 y 88B y para PS2 en el aislado 67. La comparación de la secuencia de aminoácidos del producto de PCR de PS2 con la proteína de referencia PS2Aa1 mostró un porcentaje de identidad del 99%. Así mismo, se evidenció una relación filogenética estrecha entre las secuencias de los amplicones de interés de los aislados 67 y 88B, sugiriendo un alto nivel de conservación entre los genes que codifican PS1 y PS2. Hasta el momento, este es el primer informe de investigaciones con toxinas PS en el territorio colombiano, indicando la existencia de aislados nativos en el país con potencial para la producción de estas proteínas.
- PublicaciónAcceso abiertoToxic activity, molecular modeling and docking simulations of Bacillus thuringiensis Cry11 toxin variants obtained via DNA shuffling(2018-10-17) Suárez Barrera, Miguel Orlando; Florez, Alvaro M.; Morales, Gloria M.; Rivera, Karen Viviana; Orduz, Sergio; Ochoa, Rodrigo; Guerra, Diego; Muskus, CarlosThe Cry11 family belongs to a large group of d-endotoxins that share three distinct structural domains. Among the dipteran-active toxins referred to as three-domain Cry11 toxins, the Cry11Aa protein from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) has been the most extensively studied. Despite the potential of Bti as an effective biological control agent, the understanding of Cry11 toxins remains incomplete. In this study, five Cry11 variants obtained via DNA shuffling displayed toxic activity against Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus. Three of these Cry11 variants (8, 23, and 79) were characterized via 3D modeling and analysis of docking with ALP1. The relevant mutations in these variants, such as deletions, insertions and point mutations, are discussed in relation to their structural domains, toxic activities and toxin-receptor interactions. Importantly, deletion of the N-terminal segment in domain I was not associated with any change in toxic activity, and domain III exhibited higher sequence variability than domains I and II. Variant 8 exhibited up to 3.78- and 6.09-fold higher toxicity to A. aegypti than Cry11Bb and Cry11Aa, respectively. Importantly, variant 79 showed an a-helix conformation at the C-terminus and formed crystals retaining toxic activity. These findings indicate that five Cry11 variants were preferentially reassembled from the cry11Aa gene during DNA shuffling. The mutations described in loop 2 and loop 3 of domain II provide valuable information regarding the activity of Cry11 toxins against A. aegypti and C. quinquefasciatus larvae and reveal new insights into the application of directed evolution strategies to study the genetic variability of specific domains in cry11 family genes.