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Identificación de Genes de Lipasas Extracelulares en Candida Palmioleophila y su Relación con Genes Lip2 y Lip6

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dc.contributor.advisorValdivieso Quintero, Wilfredo
dc.contributor.authorHernández Garnica, Esperanza
dc.date.accessioned2021-09-06T16:20:09Z
dc.date.available2021-09-06T16:20:09Z
dc.date.issued2021-08-24
dc.descriptionDigitalspa
dc.description.abstractEl objetivo del presente estudio fue identificar secuencias genéticas ortólogas de lipasas extracelulares LIP2 y LIP6 presentes en microorganismos modelo de Candida palmioleophila (Nakase&Itoh 8040), sin embargo, durante el desarrollo de este estudio se incluyó la identificación de secuencias genéticas ortólogas de lipasas extracelulares LIP1. Se estableció una estrategia experimental que incluyó el uso de oligonucleótidos previamente reportados y nueve parejas de oligonucleótidos diseñados (LIP1, LIP2, LIP6), para las amplificaciones se utilizó tanto ADNg como ADNc. Los 61 amplificados obtenidos (14 de C. albicans y 47 de C. palmioleophila) fueron sometidos a secuenciación, de los cuales se obtuvieron 87 secuencias (74 a partir de ADNg y 13 a partir de ADNc), el análisis de los fragmentos depurados para C. palmioleophila permitió identificar tres amplificados (Cp9, Cp39 y Cp47) que presentaron algún grado de homología con secuencias genéticas asociadas a lipasas en GenBank y de estas secuencias genéticas, se obtuvieron tres marcos de lectura (ORF) con algún grado de homología a αβ hidrolasa o lipasas de levaduras en BLASTp, Pfam e InterPro. Las secuencias de nucleótidos Cp9, Cp39, Cp47 y sus respectivos ORF fueron sometidos a un análisis filogenético. Adicionalmente este trabajo permitió obtener información nueva sobre secuencias de ADN putativas para C. palmioleophila, que pudieron ser reportadas en GenBank, permitiendo ampliar el conocimiento que se tiene de este microorganismo.spa
dc.description.abstractThe objective of the present study was to identify orthologous genetic sequences of extracellular lipases LIP2 and LIP6 present in model microorganisms of Candida palmioleophila (Nakase & Itoh 8040), however, during the development of this study the identification of orthologous genetic sequences of extracellular lipases LIP1 was included. An experimental strategy was established that included the use of previously reported oligonucleotides and nine pairs of designed oligonucleotides (LIP1, LIP2, LIP6), both gDNA and cDNA were used for the amplifications. The 61 amplified obtained (14 from C. albicans and 47 from C. palmioleophila) were subjected to sequencing, of which 87 sequences were obtained (74 from gDNA and 13 from cDNA), the analysis of the purified fragments for C. palmioleophila allowed the identification of three amplified (Cp9, Cp39 and Cp47) that showed some degree of homology with genetic sequences associated with lipases in GenBank and from these genetic sequences, three open reading frame (ORF) with some degree of homology to yeast αβ hydrolase or lipases were obtained in BLASTp, Pfam and InterPro. The nucleotide sequences Cp9, Cp39, Cp47 and their respective ORF were subjected to phylogenetic analysis. Additionally, this work allowed to obtain new information on putative DNA sequences for C. palmioleophila, which could be reported in GenBank, allowing to broaden the knowledge of this microorganism.spa
dc.description.degreelevelMaestríaspa
dc.description.degreenameMagister en Biotecnologíaspa
dc.description.edition1 ed.spa
dc.description.tableofcontentsIntroducción .................................................................................................................................. 18 1. Problema de Investigación ........................................................................................................ 20 2. Pregunta de Investigación ......................................................................................................... 23 3. Justificación .............................................................................................................................. 24 4. Objetivos ................................................................................................................................... 27 4.1 Objetivo General ................................................................................................................. 27 4.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 27 5. Marco de Referencial ................................................................................................................ 28 6. Marco Teórico ........................................................................................................................... 31 6.1 Lipasas ................................................................................................................................. 31 6.2 Estructura de las Lipasas ..................................................................................................... 32 6.3 Reacciones Catalizadas por lipasas ..................................................................................... 34 6.4 Aplicaciones Biotecnológicas ............................................................................................. 35 6.5 Microorganismos Productores de Lipasas........................................................................... 37 6.6 Genes Lipasa en Levadura del Género Candida sp ............................................................ 38 6.7 Genes Homólogos, Ortólogos y Parálogos ......................................................................... 40 6.8 Similitud de los Genes Lipasa ............................................................................................. 41 7. Metodología .............................................................................................................................. 45 7.1 Tipo de Estudio ................................................................................................................... 45 7.2 Estrategia Experimental ...................................................................................................... 45 7.3 Microorganismos y Condiciones de Cultivo ....................................................................... 46 7.4 Obtención de ADN Genómico (ADNg) y ADN Complementario (ADNc) ....................... 47 7.4.1 Extracción de ADNg de Levaduras .............................................................................. 47 7.4.2 Extracción de ARN Total ............................................................................................. 48 7.4.3 Obtención de ADNc por Retrotranscripción ................................................................ 50 7.5 Amplificación de Genes de Lipasa Utilizando Oligonucleótidos Previamente Reportados 51 7.6 Diseño de Oligonucleótidos Para Amplificación de Fragmentos de Genes Asociados a Lipasas Extracelulares ............................................................................................................... 53 7.7 Optimización de las Condiciones de PCR para los Oligonucleótidos Diseñados ............... 54 7.8 Secuenciación de Amplicones y Análisis............................................................................ 56 7.9 Análisis de Marcos de Lectura Abierta (ORF).................................................................... 57 7.10 Análisis Filogenético de Secuencias Obtenidas con Similitud a Genes Lipasa ................ 58 8. Resultados y Discusión ............................................................................................................. 59 8.1 Microorganismos y Condiciones de Cultivo ....................................................................... 59 8.2 Obtención de ADN Genómico (ADNg) y ADN Complementario (ADNc) ....................... 59 8.2.1 Obtención de ADNg, Verificación de Calidad y Pureza .............................................. 59 8.2.2 Obtención del ADNc, Verificación de Funcionalidad y Pureza ................................... 60 8.3 Amplificación de Genes Lipasa Utilizando Oligonucleótidos Previamente Reportados .... 62 8.4 Diseño de Oligonucleótidos para Amplificación de Fragmentos de Genes Asociados a Lipasas Extracelulares ............................................................................................................... 65 8.5 Optimización de Condiciones de PCR para los Oligonucleótidos diseñados ..................... 69 8.6 Amplificación de Genes Lipasa Utilizando Oligonucleótidos Diseñados .......................... 71 8.6.1 Amplificación de Genes Lipasa a Partir de ADNg ....................................................... 71 8.6.2 Amplificación de Genes Lipasa a Partir de ADNc ....................................................... 75 8.7 Secuenciación de Amplicones y Análisis............................................................................ 80 8.7.1 Análisis de Secuencias Genéticas Obtenidas a partir de ADNg Utilizando Oligonucleótidos Previamente Reportados ........................................................................... 80 8.7.2 Análisis de Secuencias Genéticas Obtenidas a partir de ADNg Utilizando Oligonucleótidos Diseñados .................................................................................................. 83 8.7.3 Análisis de Secuencias Genéticas Obtenidas a Partir de ADNc Utilizando Oligonucleótidos Diseñados .................................................................................................. 87 8.8 Análisis Filogenético de Secuencias Obtenidas con Similitud a Genes Lipasa .................. 90 9. Conclusiones ............................................................................................................................. 97 10. Recomendaciones ................................................................................................................... 98 Referencias Bibliograficas ............................................................................................................ 99 Apéndices .................................................................................................................................... 110spa
dc.format.extent186 pspa
dc.format.mimetypeapplication/pdfspa
dc.identifier.localT 91.21 H276i
dc.identifier.urihttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/5604
dc.language.isospaspa
dc.publisherBucaramanga : Universidad de Santander, 2021spa
dc.publisher.facultyFacultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuariasspa
dc.publisher.placeBucaramanga, Colombiaspa
dc.publisher.programMaestría en Biotecnologíaspa
dc.rightsDerechos Reservados - Universidad de Santander, 2021spa
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessspa
dc.rights.creativecommonsAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)spa
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/spa
dc.subject.proposalPCRspa
dc.subject.proposalDiseño Primersspa
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dc.subject.proposalLipasaspa
dc.subject.proposalIdentificaciónspa
dc.subject.proposalDesign Primerseng
dc.subject.proposalGeneseng
dc.subject.proposalLipaseeng
dc.subject.proposalIdentificationeng
dc.titleIdentificación de Genes de Lipasas Extracelulares en Candida Palmioleophila y su Relación con Genes Lip2 y Lip6spa
dc.typeTrabajo de grado - Maestríaspa
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