Diseño y Evaluación de Oligonucleótidos Para el Clonaje de un Fragmento de ADN Asociado con Lipasas Extracelulares de Candida palmioleophila en el Vector de Expresión pKLAC2
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Resumen en español
La levadura Candida palmioleophila (C. palmioleophila) es un microorganismo con potencial para la producción de lipasas. Se ha investigado sobre los genes que codifican proteínas con actividad lipolítica en esta levadura, sin embargo, a la fecha se ha expresado solo uno que corresponde a una proteína de alrededor de 27 KDa. El objetivo del presente trabajo es diseñar oligonucleótidos que permitan la amplificación de una secuencia de ADN asociada con lipasas extracelulares de C. palmioleophila para su inserción en vectores de expresión. Para lograr esto, se realizó el diseño de oligonucleótidos que permitan la amplificación del fragmento de interés en este caso un segmento denominado Secuencia 8 (Sec8). Los oligonucleótidos se evaluaron para identificar la especificidad de la amplificación y luego ser usados para reacción en cadena de la polimerasa (RCP) convencional. Se observo una correcta amplificación permitiendo confirmar, que los oligonucleótidos diseñados eran funcionales, así mismo se dio una correcta escisión por parte de las enzimas en el plásmido y en la secuencia, sin embargo, no se logró evidenciar la inserción del fragmento amplificado en el vector de expresión. Aunque no se obtuvieron clones con la secuencia esperada, este trabajo permitió identificar que los oligonucleótidos diseñados permiten la amplificación del fragmento de ADN de la lipasa Seq8.
Resumen en ingles
Candida palmioleophila (C. palmioleophila) is a yeast with potential for lipase production. Some genes encoding proteins with lipolytic activity has been studied in this yeast, however, to date only one has been expressed, corresponding to a protein of about 27 KDa. The aim of this work is to design oligonucleotides that allow the amplification of a DNA sequence associated with extracellular lipases of C. palmioleophila for insertion into expression vectors. To achieve this, we designed oligonucleotides that allow the amplification of the fragment of interest, in this case a segment called Sequence 8 (Sec8). The oligonucleotides were evaluated to identify the specificity of amplification and then used for conventional polymerase chain reaction (PCR). A correct amplification was observed, confirming that the designed oligonucleotides were functional, as well as a correct excision by the enzymes in the plasmid and in the sequence; however, the insertion of the amplified fragment in the expression vector was not evidenced. Although clones with the expected sequence were not obtained, this work allowed identifying that the designed oligonucleotides allow the amplification of the Seq8 lipase DNA fragment.